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如何用oligo设计基因敲除的引物
在你拟“敲入片段引物（17-20bp）”的2侧，连接上同源重组臂（36-50bp），扩增产生：中间是敲入片段，2翼是重组臂（即拟敲除基因的外侧序列）的一个杂合序列，转化进入细胞，后边你就知道了。。
引物最好在模板cDNA的保守区内设计。引物长度一般在15-30碱基之间。引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72℃。引物3′端要避开密码子的第3位。引物3′端不能选择A，最好选择T。
可以使用oligo 6 或者primer5 等软件设计。用这些软件选择引物，主要就是看引物的稳定性，形成二聚体的可能性，退火温度等等参数。如果你的序列同源性不高，GC含量也还可以的话，可以使用一些经验性原则。
一般是通过设计软件，例如oligo6，primer5等，你可以在网上搜一下引物设计软件下载和使用说明，是比较容易的。
如何有效设计引物 （1）使用Oligo或Primer设计引物，在保守区内设计，长度一般在18-27bp，上下游引物Tm值最好是60-75℃，GC含量=40%-60%，引物自身及引物之间不应存在互补序列，避免发夹结构。
PCR引物怎么设计?
网址引物设计和验证的推荐网站为：Primer-Blast。这是一个专门设计用于在已知序列上设计引物或探针的工具。
引物5’端可以修饰。引物5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。验证引物的特异性：在“Primer Pair Specificity Checking Parameters”区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。
PCR是分子生化学生必备技能，简单朴实但是必不可少，是许多分子实验进行下去冲锋员。
PCR引物设计的11条黄金法则 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
PCR的技术的主要步骤及PCR引物设计的一般原则分述如下：PCR的技术的主要步骤：DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。
按照不同的物种对MM子的偏好性设计简并引物；对环型DNA片段，设计反向PCR引物；设计多重PCR引物。
